感受态细胞的制备过程和原理
2015-6-28 9:36:47 点击：
实验目的
为了获得很多的质粒作为克隆载体，咱们需要将购买来的质粒经过转化的办法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，咱们就能够便利的将需克隆的质粒导入其中，使其繁衍，就能获得很多质粒。本次试验的意图就是添加质粒的数量。同时，咱们能把握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和试验技术办法。
1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培育基中，37℃，180rpm培育过夜。
[让菌复苏，进入对数期的早中期。此刻更简单制得感受态细胞。]
2取0.4mL过夜培育物参加到40mL LB(无抗生素)培育基中，37℃250rpm大概2.5小时。
[削减到达所需亮的均所需繁衍的世代数，以削减菌的变异。]
3取培育物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。（将一切上清倒光，能够将离心管倒过来）
[使细菌的成长中止，代谢减慢。由于这时现已没有培育基了，假如细菌仍有很高的代谢功率，则有很多细菌逝世。]
4菌体重悬于10mL 100mmol/L严寒CaCl2中，轻吹，4℃ 30min，4000rpm离心5min弃上清。
[ 细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞胀大成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞外表（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，推进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁翻开，非常软弱）]
5菌体重悬于1mL 100mmol/L严寒的CaCl2中，轻吹，用于转化。
[除去一切的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。避免细胞分裂，致使很多细胞逝世。（一定要轻吹，这时细胞壁翻开，非常软弱）]
6 取感受态细胞100uL，参加2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL，参加2 uL无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，参加2 uL阴性对照
[ 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶液和pET-21a质粒未被污染。]
[冰浴是为了降低细胞代谢率，避免细胞很多逝世。]
7 热激 42度，90s
【在低温处理后，热激，能够使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】
8冰浴2 min
9参加800 uL 无抗生素的 LB，37℃复苏1h
【用LB复苏细胞，使细胞康复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只要这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上成长。】
10 取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧苄西林)的LB培育基上铺平板，将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培育过夜，出现菌落。
【 这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应当没有菌落。在意图菌落的旁边有也许出现卫星菌落，这是由于亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸安稳、不易被细菌降解，所以能够降低卫星菌落的数量。
由于抗生素高温易失活，所以应比及LB600C时（热而不烫），参加抗生素。】
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