公告动态   News
联系我们   Contact
搜索   Search
你的位置:首页 > 公告动态 > 行业新闻

质粒的制备

2015-6-28 9:34:52      点击:


一、目的

掌握质粒的常用提取方法及其定量测定。
 
二、原理
质粒(Plasmid)是游离于细胞染色体之外的具有自行复制子的双链闭环的DNA分子,其大小范围从1kb至200kb以上不等。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构,能在宿主细胞独立自主地进行复制,并在细胞分裂时保持恆定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息,所以会赋予宿主细胞一些遗传性状,根据质粒赋予细胞的表型可识别质粒的存在,是筛选转化子细胞的根据。质粒的质粒分为两类:原核细胞表达质粒和真核细胞表达质粒。
分子生物学实验中用于重组DNA技术的质粒常常为经过改造的细菌质粒,它通常具有以下特征:①多克隆位点(MCS):为一些限制性内切酶的单一识别位点,可将外源DNA在这些位点上插入构成重组体,而不破坏质粒的生存能力及特性;②选择标志:常为抗药性基因,如抗卡那霉素基因(Ken+)。这是一种显性基因,其产物是一种酶,能够分解相应的药物(如卡那霉素)。因此,被这种质粒转化的细菌便能够在含有相应药物的培养基中繁殖,据此可判断细菌转化实验是否成功;③复制子(Promoter):是一段具有特殊结构的DNA序列,能启动DNA分子的自行复制,此外还带有一些编码质粒复制过程中必须的RNA和蛋白质的基因。
质粒提取的方法有多种:碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。本实验采用碱裂解法,即在碱及SDS作用下菌体破碎,质粒释出,而细菌染色体仍附在细胞膜上,可通过离心除去。
 
三、试剂
2M  Glucose          0.25ml
1M  Tris-HCl (pH 8.0)  0.25ml
0.1M EDTA (pH 8.0)    1.00ml
灭菌水               8.50ml,
临用现配。   
2. 0.2N NaOH/1%SDS:
        灭菌水                7.00ml
       1N  NaOH            2.00ml
       10%  SDS            1.00ml
3. 氯仿(Chloroform)(AR)
4. 异丙醇(Isopropanol)(AR)
5. 70%冰乙醇(Ethanol)(AR)
6. 4M NaCl:116.9gNaCl溶于300ml蒸馏水中,再加蒸馏水至500ml。室温保存。
7.  13%PEG8000:13g PEG8000溶于60ml蒸馏水中,再加蒸馏水至100ml,然后用0.22 μm滤器除菌过滤,4 oC保存。
8. 3M KAc(pH4.8):29.4g KAc,加少量蒸馏水溶解,用乙酸将pH调至4.8(约50ml),再加蒸馏水至100ml,室温保存。

9.去离子水
10.10mg/ml Rnase A:100mg DNase-free Rnase A加10ml TE缓冲液,加热100 oC 10min以灭活DNase,然后逐渐冷却。-20 oC保存。
11.1M Tris-HCl(pH8.0):蒸馏水600ml;Tris 60.6g;HCl 15ml;用HCl将pH调至8.0,再加蒸馏水至500ml。
12.2M Tris-HCl(pH7.4):蒸馏水300ml;Tris 121.2g;HCl 35ml;用HCl将pH调至7.4,再加蒸馏水至500ml。
13.2M 葡萄糖:36g葡萄糖,溶于60ml蒸馏水中,再加蒸馏水至100ml,然后用0.22 μm滤器除菌过滤,-20 oC保存。
14.0.1M EDTA:  18.7g EDTA-Na2-2H2O,溶于300ml蒸馏水中,加入1 N NaOH约40ml,继续将pH调至8.0,加蒸馏水至500ml, 室温保存。
15.1N NaOH:40g NaOH,溶于60ml蒸馏水中,再加蒸馏水至1000ml,室温保存。
16.10%SDS:10g SDS,溶于60ml蒸馏水中,再加蒸馏水至100ml,室温保存。
17.TE缓冲液:10mM Tris(pH7.4)0.5ml;0. 1Mm EDTA(pH8.0)0.1ml;加蒸馏水至10ml。
18.50mg/ml卡那霉素
 
四、实验仪器
1.      37℃水浴箱  (北京市医疗设备厂 型号:BS2型)
2.      高速离心机  (珠海黑马医学仪器有限公司 型号:TGL-16H型)
3.      紫外分光光度计    (上海第三分析仪器厂 型号:UV-754型)
4.      4℃低温离心机    (珠海黑马医学仪器有限公司 型号:TGL-18R型)
5.      离心管(1.5ml和0.5ml)
6.      微量加样器吸头
7.      微量加样器(1—10μl,1—100μl,200μl,1000μl)
8.      冰盒
 
五、实验步骤
1.将含pBKcmv-hMLCK1的XL1-blue大肠杆菌接种到含有卡那霉素的固体培养基上(每毫升培养基加1μl 50mg/ml卡那霉素),37 oC孵育24h;
2.用灭菌牙签挑选一单个菌落接种到3.0mlLB培养基中(含3μl卡那霉素),37 oC振荡培养过夜;
3.3000rpm离心10min;轻轻倾去上清液,离心管倒置滤纸上片刻;
4.将沉淀重悬于200μl GTE缓冲液中,转移至1.5ml 离心管中;
5.加300μl NaOH/SDS液,颠倒混匀,置冰上5min;
6.加300μl 3M KAc(pH4.8),混匀,置冰上5min;
7.14000rpm,离心10min,将上清液移入另一1.5ml离心管中;
8.上清液中加1.6μl 10mg/ml Rnase A,37 oC孵育20min;
9.加氯仿400μl,混匀30sec,14000rpm离心1min,取上清液0.7ml置另一1.5ml离心管中,再用400μl氯仿提取一次;
10.取上清液0.6ml加入等体积异丙醇,混匀,14000rpm离心10min,倾去上清液,离心管倒置滤纸上片刻;
11.沿管壁慢慢加入0.5ml预冷70%乙醇,洗涤沉淀,14000rpm离心5min,倾去上清液,离心管倒置滤纸上片刻,真空干燥5min或室温干燥;
12.用32μl灭菌水溶解沉淀物,加8μl 4M NaCl和40μl 13%PEG8000,混匀,置冰上20min;
13.14000rpm,4 oC离心15min,弃去上清液;
14.沿管壁慢慢加入0.5ml预冷70%乙醇,洗涤沉淀,14000rpm离心5min,倾去上清液,离心管倒置滤纸上片刻,真空干燥5min或室温干燥;
15.用20μl灭菌水溶解DNA;
16.取5μl DNA溶液用495μl灭菌水稀释,用UV分光光度计比色,读取A260和A280吸光度值,计算出A260 /A280   比值及质粒DNA浓度。
 
六、结果   
1. 按下列公式计算DNA浓度: 
 
    质粒DNA浓度(μg/μl)= A260×稀释度/20= A260×5 
                                                                                                                                                                
 2.质粒DNA的纯度和含量测定结果:
          A260=
          A280=
          A260/A280
          质粒DNA含量=        μg/μl;
 
3.若A260 /A280比值在⒈8---⒉0之间,说明质粒DNA纯度高,
若A260 /A280<⒈8,则说明提取的质粒DNA中,还有蛋白质没有除去;
若A260 /A280>⒉0,则说明提取的质粒DNA中,还有RNA没有除去。
 
七﹑注意事项 
1.NaOH/SDS液需现用现配,且这一步反应需要充分混匀,使细胞裂解。
2.整个过程动作轻柔,防止提取的DNA链断开。

    ⒈ GTE缓冲液:

3.碱裂解第11、14步离心后要缓慢倒上清液,防止将管底的DNA沉淀一起倒出。