WB技术常见问题分析
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问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
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样品中有粘粘糊糊的东西 |
DNA从破碎的细胞中释放出来 |
可以用酶，或机械方式将它打断 |
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加入上样缓冲液后，样品偏黄绿色 |
样品的PH不对 |
使用缓冲液平衡PH值 |
制胶
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问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
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胶不平 |
胶板上有杂质 |
胶板洗刷干净 |
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APS和TEMED过量 |
加入合适量的APS和TEMED |
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混合不均匀 |
加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 |
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受热不均匀导致胶聚合不均匀 |
降低室温 |
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凝胶 漏液 |
胶板上有杂质 |
胶板洗刷干净 |
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底部漏液 |
对齐两块玻璃板底部 |
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玻璃板是否有破损 |
更换玻璃板 |
电泳
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问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
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“微笑” 或 “倒微笑” 条带 |
凝胶聚合不均匀 凝胶过快 拔梳子时不要破坏加样孔 清洗加样孔时破坏了加样孔 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一 胶板底部有气泡会影响电泳 电泳时电流太大 电泳时温度过高 |
灌胶时候尽量混合均匀 聚合不能太快 拔梳子及清洗加样孔要小心 纯化样品，调整盐浓度 应赶走气泡 减小电压电流 降温 |
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条带 扭曲 |
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条带 模糊 |
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条带比 正常的窄 |
蛋白转印
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问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
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凝胶肿胀或卷曲 |
凝胶内的液体不平衡 |
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min |
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条带歪斜或漂移 |
长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。 |
可在两块海绵之间垫上少许普通的滤纸 |
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单个或多个白点 |
气泡阻碍了电流 |
确保膜和胶块之间没有气泡 |
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转膜缓冲液过热 |
缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。 |
转膜过程注意降温 |
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转膜 不充分 |
膜没有完全均匀湿透 |
使用100% methanol浸透膜 |
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靶蛋白分子量小于10,000 |
选择小孔径的膜，缩短转移时间 |
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靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 |
可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 |
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甲醇浓度过高 |
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 |
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转移时间不够Thick gel |
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间 |
其他
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问题 |
可能原因 |
验证或解决办法 |
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背景高 |
膜没有完全均匀湿透 |
使用100% methanol浸透膜 |
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洗膜不充分 |
增加洗液体积和洗涤次数 |
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阻断不充分 |
增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等） |
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二抗浓度过高 |
降低二抗浓度 |
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检测过程中膜干燥 |
保证充分的反应液，避免出现干膜现象 |
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曝光过度 |
缩短曝光时间 |
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抗体与阻断蛋白有交叉反应 |
检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应 |
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没有 阳性条带 |
抗体染色不充分 |
增加抗体浓度，延长孵育时间 |
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酶失活 |
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 |
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标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。 |
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试剂不匹配 |
一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性 |
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一抗失效 |
选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液 |
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HRP抑制剂 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 |
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有阳性条带，但条带比较弱 |
抗体染色不充分 |
增加抗体浓度，延长孵育时间 |
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酶活性降低 |
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 |
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标本中靶蛋白含量太低 |
增加标本上样量 |
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洗膜过度 |
缩短洗涤时间 |
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HRP抑制剂 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 |
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抗体活性降低 |
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置 |
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蛋白转移不充分 |
见上述 |
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封闭过度 |
减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型 |
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曝光时间过短 |
延长曝光时间 |
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HRP抑制剂 |
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 |
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条带位置（大小）不对；或有非特异性条带 |
二抗的非特异性结合 |
增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的） |
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一抗的特异性不够 |
使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性 |
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蛋白降解 |
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 |
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二聚体或多聚体存在 |
增加蛋白质变性过程及强度 |
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抗体浓度过高 |
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带 |
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蛋白上样量过大 |
降低上样量 |
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背景 有斑点 |
封闭剂中有聚集体 |
使用前过滤封闭试剂 |
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HRP耦联二抗中有聚集体 |
过滤二抗试剂，去除聚集体 |
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膜上出现反像（暗背景上白色带） |
HRP含量过高 |
降低酶联二抗的浓度 |
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